如何在智能告警平台CA触发测试告警
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2022-12-21
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方法提要
多环芳烃在二氯甲烷中有较大溶解度,在此采用二氯甲烷提取水样中的 16 种特定多环芳烃,提取液经硅胶层析柱或凝胶渗透色谱净化、浓缩、定容后 GC-MS 选择离子检测。
方法适用于地下水、地表水、饮用水和污水中 16 种特定多环芳烃分析。方法检出限随仪器和操作条件而定,当取样量为 1.0L 时,本方法检出限在 1.0ng/L。
仪器与装置
气相色谱-质谱联用仪 EI 源,带自动进样器。
凝胶渗透色谱仪 (GPC) 带 Phenomenex Envirosep ABC size 350 × 21.20mm 0 micron净化柱。
色谱柱 DB -5ms 弹性石英毛细柱 30m ×0.32m,0.25μm 膜后或性质相似色谱柱。
硅胶层析净化柱 规格 30cm ×1.0cm。填 6g 活化后的硅胶。
旋转蒸发器,氮气吹扫仪。
1L 分液漏斗、KD 浓缩瓶等。
试剂
二氯甲烷、正己烷均为农残级。测定前应进行空白检验。
无水硫酸钠、氯化钠 分别在 600℃马弗炉中灼烧 4h,冷却后存放在干燥器中备用。
16 种多环芳烃标准溶液 苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并 [a] 蒽、 、苯并 [b] 荧蒽、苯并 [k] 荧蒽、苯并 [a] 芘、茚并 [1,2,3-cd] 芘、二苯并 [a,h]蒽、苯并 [ghi]苝等,各化合物浓度为2000μg/mL。
氘代标记内标化合物溶液 氘代苊、氘代菲、氘代 、氘代苝,各化合物浓度为500μg / mL,正己烷介质。正己烷逐级稀释至 10μg / mL。
替代物溶液三联苯-d14,1mg/mL 甲醇溶液。-18℃温避光保存。
硅胶 80~120 目,300℃马弗炉中灼烧 5h,冷却后保存在干燥器中备用。使用前在一个浅盘中于 130℃至少活化 8h,冷却后存放在干燥器中。
分析步骤
1) 样品提取。
a.液-液萃取。将 1.0L 水样倒入预先加有 30gNaCl 的 1L 分液漏斗中,待 NaCl 溶解后加入 50mL 二氯甲烷、5μL 10.0μg/mL 三联苯-d14替代物标准溶液,并用 20mL 丙酮淋洗样品瓶,淋洗液转入分液漏斗,振荡 5min,静置 10~ 20min,二氯甲烷相转入 150mL平底烧瓶中。原样品再进行第二次萃取,萃取方法同第一次,二氯甲烷量减少为 30mL。合并二氯甲烷相,并加入 3g 无水硫酸钠,轻轻摇摇,观察有无结块现象,如有结块,补加无水硫酸钠至沙状,继续放置 20min,之后过滤于另一 150mL 平底烧瓶中。如果是洁净地下水样品则不需净化,滤液加入1.0mL 正己烷旋转蒸发浓缩至约3mL。转移至 KD 浓缩瓶中,氮气吹扫至 0.5mL,加入正己烷 1.0mL,氮气吹扫至 0.5mL,再加正己烷 1.00mL,氮气吹扫至 0.5mL,最后加入 10μg/mL 内标混合物 5μL 正己烷定容 1.0mL,GC-MS 测定。如污染较重,则需净化。当采用硅胶柱净化时二氯甲烷滤液中加入 1mL 正己烷,旋转蒸发至 3mL,再加入 3mL 正己烷,继续旋转蒸发到约为 3mL,接方法 1 硅胶层析柱净化。当采用 GPC 净化时二氯甲烷滤液旋转蒸发至 5mL,再转移至 5mL 比色管定容至3.00mL,接方法 2 GPC 净化。
b.固相萃取。C18柱 (1000mg,6mL) 的活化、上样前样品制备、上样、淋洗、脱水基本与 82.12 固相萃取同,只是替代物标准 p-三联苯改为三联苯-d14,最后换相为正己烷,定容前加入 10μg/mL 内标混合溶液 5μL,GC-MS 测定。
2) 净化。
方法 1 硅胶层析柱净化。样品提取液转移到事先已分别用 10mL 二氯甲烷-正己烷、25mL 正己烷淋洗过硅胶层析柱上,再用 2mL 正己烷来定量完全样品转移。在硫酸钠层刚刚露出空气之前,加 25mL 正己烷淋洗硅胶柱,弃之流出液。然后用 25mL 二氯甲烷-正己烷 (1∶ 1,V∶ V) 淋洗硅胶柱,淋洗液收集在 30mL KD 浓缩瓶中,N2吹至 0.5mL,加正己烷 2mL,N2再次吹至 1mL,加入 10μg/mL 内标氘代苊、氘代菲和氘代苝 5μL,最后定容至 1.0mL,GC-MS 测定。
方法2 GPC 净化。待净化试液定容至 3.0mL,取 2.5mL 上 GPC Phenomenex EnvirosepABC size 350 × 21.20mm 净化柱。GPC 的流动相为二氯甲烷,定量环为 2mL,紫外检测器。清洗 15min 后上样,流速为5mL/ min,柱温24℃,收集所需馏分时间为18~26min,排出废液时间为5min。收集的馏分加入2mL 正己烷,旋转蒸发至约为 3mL,转移至 KD 浓缩瓶中,氮气吹到0.5mL,再加入1mL 正己烷,氮气吹至 0.5mL,最后加入 10μg/mL 内标混合溶液5μL 定容至 1.0mL GC-MS 测定。
3) GC-MS 分析条件。
色谱条件。进样口温度,290℃; 不分流进样,进样量 1μL。柱前压 12 ×6894.76Pa。升温程序: 初温 70℃,保持 2min,再以 5℃ /min 升温至 300℃,保持 5min。
质谱条件。离子源温度 220℃; 接口温度,280℃; 扫描范围为 50~ 400m/z; 电离电压 70eV。定性分析采用全扫描方式,定量分析采用选择离子检测 SIM,各目标化合物检测特征质量数见表82.36。
表82.36 目标化合物检测特征离子
续表
4) GC-MS 仪器调谐。参考 82.12 GC-MS 系统性能测试。
5) 校准曲线。用正己烷将多环芳烃标准储备液 (2000μg / mL) 逐级稀释至 10.0μg / mL,再稀释配成0.00ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL 标准系列。氘代内标溶液以正己烷稀释至 10.0μg/mL。定容前将替代物标准、内标加到标准系列中,加标量与试样同。
6) 多环芳烃标准溶液的总离子流色谱图(图82.11) 。
图82.11 16 种多环芳烃标准溶液总离子流图
7)定性及定量分析。
定性分析:参见82.12定性分析部分。
定量分析:内标法,参见82.12定量分析部分。
8)方法性能指标。取1.0L水样,加入50.0ng替代物标准,20.0ng16种多环芳烃混合标准,之后与试样预处理和分析步骤相同。测定回收率为75.4%~96.2%。
质量控制
参照82.14.1质量控制部分。
分辨率(Resolution)是指质谱仪区分两个质量相近质谱性能测试的离子的能力 。
计算公式: R=m/∆m
计算方法有两种:
分辨率越高,同一物质采集的分子量的峰的精细程度越大,准确度越高。
但是,分辨率设置越高,扫描所需的时间越长。所以,要同时兼顾分辨率和扫描速度。
一般大规模组学数据, Thermo公司的orbitrap系列仪器,一般一级分辨率设置在70000左右,能够精确分辨小数点后两位。
准确度(accuracy)指离子测量的准确性。一般用真实值和测量值之间的误差来评价,单位ppm (part per million)。主要取决于质量分析器的性能和分辨率的设置。
灵敏度(sensitivity)是指检测器对一定样品量的信号响应值,即最少样品量的检出程度。
一般对于纯的标准物质而言,灵敏度可达到fmol级别。
但是, 高的灵敏度不一定能检测到目标蛋白 ,一是样品本身信息量大,DDA模式中只有信号响应高的物质才能检测到质谱性能测试;二是肽段离子化才能采集数据,离子化效率低,可能在传输过滤中过滤掉。
ppm ,即百万分之一,如果质谱检测极限在1ppm,就表示能检测含量在百万分之一的物质。
Da ,指原子质量单位,如 C 就是12Da。mDa,一般在高分辨质谱仪上有这个参数,表示质谱的分辨率。
质量测量准确度
质量测量准确度是质谱定性的重要依据。其表示方法如下:
(|M-M0|÷m)×10^6(ppm)
公式中,M为离子质量的实测值;M0为离子质量的理论值;m为离子的质量数。例如,某化合物分子离子实测值为364.2504,理论值为364.2509,质量测量准确度为: |364.2504 - 364.2509|÷ 364×10^6=1.4 ppm
有时质量测量准确度也以mmu(毫质量单位)表示,表示式为 |M - M0|(mmu)
对于高分辨率质谱通常要求仪器的质量测量准确度小于1mmu(或10 ppm),才能满足定性分析的需要。
【质谱分析】是一种物理方法质谱性能测试,其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离质谱性能测试,生成不同荷质比的带正电荷的离子质谱性能测试,经加速电场的作用,形成离子束,进入质量分析器。在质量分析器中,再利用电场和磁场使发生相反的速度色散,将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量。
【原理】质谱仪原理如图所示,a为粒子加速器,电压为U1;b为速度选择器,磁场与电场正交,磁感应强度为B1,板间距离为d;c为偏转分离器,磁感应强度为B2,今有一质量为m,电量为+e的电子,经加速后,该粒子恰能通过速度选择器,粒子进入分离器后作半径为R的匀速圆周运动。
质谱仪的性能指标是它的分辨率,如果质谱仪恰能分辨质量m和m+Δm,分辨率定义为m/Δm。现代质谱仪的分辨率达 105 ~106 量级,可测量原子质量精确到小数点后7位数字。
质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。测定原子质量的精度超过化学测量方法,大约2/3以上的原子的精确质量是用质谱方法测定的。由于质量和能量的当量关系,由此可得到有关核结构与核结合能的知识。对于可通过矿石中提取的放射性衰变产物元素的分析测量,可确定矿石的地质年代。质谱方法还可用于有机化学分析,特别是微量杂质分析,测量分子的分子量,为确定化合物的分子式和分子结构提供可靠的依据。
测定蛋白质分子量的常用方法:
粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳、渗透压法、质谱法包括电喷雾离子化质谱技术和基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法(多角度激光散射)、沉降法(超速离心法)。
1、粘度法
一定温度条件下,高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性,随着分子量的增大,聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化,即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
如果高聚物分子的分子量愈大,则它与溶剂间的接触表面也愈大,摩擦就大,表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为:
聚合物、溶剂性质有关,也和分子量大小有关。K值受温度的影响较明显,而值主要取决于高分子线团在某温度下,某溶剂中舒展的程度,其数值解在0.5~1 之间。K与的数值可通过其他绝对方法确定,例如渗透压法、光散射法等,从粘度法只能测定[η]。 在无限稀释条件下:
优缺点:该方法操作简单、设备价格较低,通常不需要标准样品,但无法测定聚合物的分子量分布。
2、凝胶过滤层析法
对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量大小顺序流出,分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示: V e=K1—K2logMr
K1与K2为常数,Mr为分子量,Ve也可用Ve—Vo(分离体积),Ve/Vo(相对保留体积),Ve/Vt(简化的洗脱体积,它受柱的填充情况的影响较小)或Kav代替,与分子量的关系同上式,只是常数不同。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小,每一类型的化合物如球蛋白类,右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线,可用以测定未知物的分子量,测定时以使用曲线的直线部分为宜。
优缺点:凝胶层析技术操作方便,设备简单,样品用量少,周期短,重复性能好,条件温和,一般不引起生物活性物质的变化,而且有时不需要纯物质,用一粗制品即可,目前已得到相当广泛的应用。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性,在pH6—8的范围内,线性关系比较好,但在极端pH时,一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时,测得分子量比真实的要大,铁蛋白则与此相反,测得的分子量比真实的要小。
3、凝胶渗透色谱法
分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。
SEC法是按分子尺寸大小分离的,即淋出体积与分子线团体积有关,利用Flory的粘度公式:
K1、K2、α1、α2可以从手册查到,从而由第一种聚合物的M-Ve校正曲线,换算成第二种聚合物的M-Ve曲线,即从聚苯乙稀标样作出的M-Ve校正曲线,可以换算成各种聚合物的校正曲线。
优缺点:凝胶渗透色谱法分离速度快、分析时间短、重现性好,进样量少、自动化程度高。但设备投入较大,价格较高。
4、SDS-凝胶电泳法
SDS是十二烷基硫酸钠的简称,它是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质),使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线,可求得未知物的分子量。
优缺点:实验成本较低,仪器设备也相对很简单,一套电泳装置即可。但是精确程度相对较低,好的电泳图谱需要一定的技术。
5、渗透压法
在一种理想溶液中,渗透压与溶质浓度成正比。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。在溶质浓度不大时,它们的关系可用下式表示:
当c 趋向于0时,RTKc 趋向于0,但π/c 不趋向于0,而是趋向于一定值。测定几个不同浓度下的渗透压,以π/c对c作图,并外推至c为0时的π/c,再代入上式求得Mr。
优缺点:操作简单、快捷,实验成本低,但准确度较差,受外界温度影响较大,且要准确配置蛋白质溶液。
6、超速离心沉降法
利用超速离心沉降法测蛋白质的分子量是在较低离心转速下进行的(8000~20000r/min),离心开始时,分子颗粒发生沉降,一段时间以后,沉降的结果造成了浓度梯度,因而产生了蛋白质分子反向扩散运动,当反向扩散与离心沉降达到平衡时,浓度梯度就固定不变了。
7、光散射法
主要基于染料阴离子在蛋白质等电点前与肽链上带正电荷的基团上的结合作用.。此时生色团聚集于蛋白质分子上引起共振散射光增强,它与核酸不同的是生色团必须是带负电荷的阴离子。
光散射计算的基本公式:
8、电喷雾离子化质谱技术
电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS 测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群,通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量,由于ESI-MS可以产生多电荷峰,因此使得测试的分子质量范围大大扩大。
优缺点:(1)对样品的消耗少,不会造成样品的大量浪费;(2)对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高;(3)能够方便地与多种分离技术联用,如毛细管电泳、高效液相色谱等,是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。
9、基质辅助激光解吸电离质谱技术
基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)是将待测物悬浮或溶解在一个基体中,基体与待测物形成混晶,当基体吸收激光的能量后,均匀传递给待测物,使待测物瞬间气化并离子化。基体的作用在于保护待测物不会因过强的激光能量导致化合物被破坏。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子,而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比,检测离子。
优缺点:(1)同ESI-MS 一样对样品的消耗很少;(2)随着质量分析器的不断改进、新的基质的不断发现和应用以及延迟萃取技术的使用,使得MALDI-MS 的最高分辨率不断提高,甚至超过ESI-MS;(3)MALDI-MS 单电荷峰占主要部分,碎片峰少,非常有利于对复杂混合物的分析,且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分,降低了对样品预处理的要求;(4)MALDI-TOF 质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广的。
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